كافة الاوساط الزراعية للبكتريا

كافة طرق عزل وتشخيص البكتريا

=======================

  للحصول على مزارع نقية للبكتريا تعزل أولا بتنميتها على أوساط زرعيه مغذية صلبة مثل وسط الببتون ومستخلص اللحم والخميرة أو على أي وسط ملائم ثم يتم تنقيتها بإحدى الطرق التالية :

اولاً / طرق تقوم على أساس الفصل الميكانيكي للكائن ألمجهري وتعتبر هذه الطريقة الأكثر استعمالا.

  Mechanical Spearation of Microorganismes   

============================================================

وتتميز بفصل خليط من الخلايا أو مجموعة من الخلايا إلى خلايا معزولة بتنميتها في وسط زرعي ملائم وبعد إن تنمو هذه الخلايا إلى مستعمرات تنقل إلى سطح الوسط الصلب لتنقيتها. ويمكن الحصول على مزارع نقية وذلك باستخدام طريقة التخافيف وصب الأطباق ثم استعمال طريقة التخطيط أو النشر للتأكد من مدى نقاوتها . ثم تحفظ كمزارع نقية على أوساط في أنابيب اختبار بصورة مائلة من الوسط الزرعي.

ثانيا : الطرق البايولوجية  Biological method:

============================

تقوم على أساس الاختلاف في الصفات الميكروبية  ستعمل لأغراض معينة فقط وهي تستعمل في العادة للحصول على مزارع نقية للبكتريا المكونة للسبورات فقط الموجودة مع البكتريا الغير مكونة للسبورات.

وفي هذه الحالة تترك المزارع المختلطة مدة من الزمن للسماح بإكمال تكوين السبورات ويتم التأكد من ذلك بالفحص ألمجهري. إذ يتم نقل جزء من البكتريا النامية على الوسط إلى أنبوبة تحوي ماء معقم ويمزج جيدا ويوضع في حمام مائي بواسطة حامل ويترك في الحمام المائي بدرجة الغليان لمدة 2-3 دقائق.وبعدها بدرجة حرارة 80 م. لمدة 10 دقائق. ثم يزال ذلك ويوضع مباشرة في ماء بدرجة حرارة الغرفة ويزرع منه في الوسط ألزرعي الصلب ويوضع في الحاضنة بدرجة حرارة 37 م. فتنمو عندئذ البكتريا المكونة للسبورات فقط . كما تستعمل الطرق البايولوجية  لفصل الأحياء المجهرية اللاهوائية عن الهوائية .

بعد العزل والتنقية تبدأ عملية التشخيص والتي تتضمن عدد من الخصائص التشخيصية وكالاتي :

1- الخصائص المظهرية Morphological Properties  

تشمل دراسة خصائص المستعمرات وصفاتها المظهرية بما فيها الشكل والحجم والارتفاع والقوام واللون والقابلية على إنتاج الصبغات والرائحة وغيرها .

 2-  الخصائص المجهرية Microsopic Properties  

   وتتضمن دراسة شكل البكتريا تحت المجهر ودراسة قابليتها على إنتاج السبورات وكيفية تجمع    الخلايا فضلا عن استجابة البكتريا لصبغة كرام ( Ge+, Ge-) .

3-   الخصائص الكيموحيوية Biochemical Properties  

تشمل عدد من الاختبارات التشخيصية مثل اختبار إنزيم الكاتليز والاوكسيديز والاندول واليوريز واختبار الحركة وتحلل الجيلاتين والنشا والدم واختبار تحلل السكريات وغيرها من الاختبارات المهمة.

4- الخصائص المصلية Serological Properties 

وتتضمن دراسة صفات وطبيعة الانتجينات Antigens  السطحية والتي تظهرها الأجسام المضادة Antibodies المناسبة والمحددة لها وهذه الصفات دقيقة ومتخصصة لأنها تعتمد على الصفات الوراثية ( الجينات ) . 

إن دراسة الخصائص المظهرية غالبا ما تتأثر بنوع الوسط ألزرعي للمستعمرات النامية على أوساط  زرعيه انتخابية Selective media إذ إن لأغلب مجاميع البكتريا وسط انتخابي خاص تنمو عليه كل مجموعة بحيث لها صفات شكلية تميزها عن غيرها وفي بعض الأحيان تثبط نمو المجاميع الأخرى من البكتريا وكما مبين كالأتي :

أ – بكتيريا Staphylococci الوسط الانتخابي Manitol salt agar وشكل المستعمرات تكون صفراء كبيرة.

ب – بكتيريا Streptococci الوسط الانتخابي Sheep blood agar  او Sodium azid agar   وشكل المستعمرات ناعمة شفافة كرأس الدبوس.

ج – بكتيريا Vibrio الوسط الانتخابي ThioSulphat Citrate Bile Salt Sucrose agar (TCBS).

د – بكتيريا coliform bacteria الوسط الانتخابي broth     McConkeyو McConkey agar وشكل المستعمرات تكون ذات لون وردي.

ه – بكتيريا  Pseudomonas الوسط الانتخابي Pseudomonas agar او King –B شكل المستعمرات شفافة ناعمة .

و – بكتيريا Salmonella الوسط الانتخابي agar  Salmonella شكل المستعمرات شاحبة .

ي – بكتيريا Shigella الوسط الانتخابي Shigella   (agar S.S) شكل المستعمرات شاحبة .

العدد الكلي لبكتريا القولون   Total coliform bacteria ( TC)   /

=========================================

يتم إجراء هذا الفحص لغرض الكشف عن بكتريا المجموعة القولونية في الماء . ومن أهم الأجناس التابعة لبكتريا القولون هي بكتريا E.coli و Klebsiella و Citrobacter و  Entrobacter.

فمن المعلوم إن العوامل المرضية التي تدخل للمياه تصل عن طريق فضلات الإنسان والحيوان إضافة إلى بعض الأنواع البكترية وخاصة E.coli   و البكتريا الأخرى من مجموعة coliform والمسبحيات البرازية Sterptococcus faecalis  و  perfingens  Clostiridium  , وهذه جميعها تكون تعايشية طبيعية Normal flora  في الأمعاء الغليضة للإنسان  والحيوان ومن المؤكد إنها موجودة في البراز لذلك فان وجود أي نوع من أنواع البكتريا التعايشية في الماء هو دليل على التلوث ألبرازي سواء مصدرها بشري أو حيواني . 

إن وجود هذه الأنواع في الماء يدل على إن الطريق مفتوح للعوامل المرضية المعوية لتدخل إلى الماء ولكونها موجودة هي الأخرى في البراز أيضا.

يتم الكشف عن  بكتريا القولون حسب الطرق التالية: 

اولاً /  طريقة الترشيح Membrane filter method  

--------------------------------

طريقة تستعمل في حساب بكتريا القولون وأساس عمل هذه الطريقة هو ترشيح كمية من الماء من خلال أغشية خاصة ثم يوضع المرشح وما بقيت عليه من البكتريا على أوساط خاصة لنمو البكتريا القولون فقط , حيث تحضن هذه الأوساط مع المرشح filter لمدة يوم أو يومين على حرارة 37م. وبعدها تعد المستعمرات النامية 

   تتميز هذه الطريقة عن الطرق الأخرى بسرعتها والحصول على نتائج خلال 18-24 ساعة . كما يمكن فحص كميات كبيرة من المياه بوقت قصير كذلك يمكن تركيز أعداد كبيرة من البكتريا وخاصة البكتريا الممرضة إذا وجدت بأعداد قليلة من خلال ترشيح كميات كبيرة من الماء ولا تحتاج هذه الطريقة إلى أجهزة أو أوساط زرعيه كثيرة. 

ومن مساؤها إنها لا  تصلح في حالة فحص المياه العكرة والأطيان العالقة تترسب على الغشاء وتعيق عملية الترشيح .

ثانياً / وتعتبر هذه الطريقة هي الأكثر اعتمادا في الدراسات وتتم كالأتي :

--------------------------------------

1-الفحص الابتدائي  او التخميني preumpitive test .

يتضمن الفحص الابتدائي تلقيح انابيب من مرق اللاكتوز Lactose broth  بكميات مناسبة من الماء تحضن بعدها الانابيب بدرجة 45 م ولمدة 24 او48 ساعة .ان عدم وجود الغاز بعد 48 ساعة يعتبر دليل على غياب بكتيريا القولون في النموذج مادامت هي احدى خواص بكتيريا القولون وهذه الخطوة تعد اولية تخمينية اذ ان هناك انواع بكتيرية اخرى تستطيع ان تخمر اللاكتوز وتحرر غاز جنب بكتيريا القولون ومن هنا جاءت ضرورة القيام بفحوصات اخرى للحصول على اثبات جديد وا يجابي حول وجود بكتيريا القولون وهذه الاثباتات تتضمن الفحص الاثباتي والفحص الكامل 

2-  الفحص الاثباتي Confirmed test 

يؤخذ نموذج من الانابيب وتزرع في (BGLB)Brillant Green Lactose- Bile Broth  .حيث ان هذا الوسط يمنع نمو مخمرات اللا كتوز التي لاتنتمي لبكتيريا القولون وبهذا فان ظهور الغاز هنا يمثل الفحص الاثباتي  اي يؤكد وجود بكتيريا القولون .بعد ذلك تنقل المستعمرات الى اطباق تحتوي على الوسط المغذي EMB Eiosin Methylene Blue Agar  حيث ان مستعمرات الE coli كبيرة غامقة ذات مركز اسود ببريق اخضر معدني في حين تكون مستعمرات A aerogenes  كبيرة وردية اللون مخاطية بمركز اسود .

3 - الفحص التكميلي Completed test 

يتم اختيار المستعمرات النموذجية من اطباق EMB agar  وتنقل الى وسط مرق اللاكتوز حيث ينتج غاز في حالة وجود بكتيريا القولون ، كما تخطط على مائل الاكار حيث تجري الفحوصات مثل التصبيغ وغيرها.

فطريات المياه الملوثة والمجاري /

===================

الفطريات الموجودة في مثل هذه المياه لها أهمية في تحلل المواد البرازية وغيرها من الفضلات الغنية بالمواد العضوية وهناك أنواع من الاعفان مثل:

 Leptomitus lacteus   

Geotrichum candidum

Fusarium aquaedudenum

لها فعالية ايضية متميزة تجعلها قادرة على النمو والتكاثر في مثل تلك الظروف من التلوث .           

إن المجاميع المختلفة من الاعفان الموجودة في مثل هذه المياه تتضمن : فطريات التربة والفطريات المائية المفترسة وفطريات مرضية أخرى تنتمي إلى مجاميع مختلفة هي :    

Predaceous fungi Imperfect fungi    و HemiAscomycetes  و EuAscomycetes  و Ascomycetidae   و   و Phycomycetes

الاعفان المائية  Pathogenic fungi

يعطي العزل الروتيني للمياه الملوثة أربع أنواع معروفة بامراضيتها للإنسان وهي : 

1-                 Geotrichum candidum

2-                 Phialophora  jeanselmei

3-                 Trichosporium heteromorphum

4-                 Aspergillus  fumigatus

 

 الذي يكون عدد كبير من السبورات ويسبب مرض Aspergillosis  وboydii Petriellidium   الذي يمكن إن يصيب العظام بما يسمى Madura foot عند دخول الجروح العميقة . كما يمكن إن يعطي العزل أنواعا مختلفة من الاعفان المرضية أمراضية للنباتات إلا انه لايوجد دليل على إمكانية حدوث إصابات واسعة للنبات عن هذا الطريق .

 عزل وعد الاعفان المائية  Aquatic fungi 

توجد الفطريات في أي مكان توجد فيه مواد عضوية وهي قليلة العدد قرب مصادر الينابيع إلا إن الأنهار تحوي عدد كبير منها متمثلة بالفطريات المائية الحقيقية True Aquatic fungi إضافة إلى الفطريات المائية وفطريات التربة وكلما زاد تلوث المياه زاد عدد الفطريات فيها.

إن العلاقة الوثيقة بين الفطريات ومحتوى المياه من المواد العضوية يمكن إن يتخذ كدليل على تلوث المياه إلا انه يوجد نوع واحد أو مجموعة معينة كدليل على التلوث . إضافة لذلك الخمائر أيضا تتخذ كدليل على التلوث المائي فمثلا وجود خميرة Candida lambica و C.krusei على أساس قدرة 

الخميرة الأولى على النمو بصورة جيدة على السكريات الخماسية Pentoses وبذلك يمكن إن تتخذ كدليلا على وجود فضلات مصانع الورق الغنية بهذه السكريات.

وتستطيع الخمائر الاعفان من النمو جيدا في درجات الحرارة المرتفعة لذا تكون ذات فائدة في معرفة التلوث الحراري Thermal pollution .

1- طريقة التخفيف / يوضع 35 مل من الماء المعقم في دورق حجمي سعة 500 مل يضاف إليه 15 مل من ماء النموذج ويوضع في خلاط كهربائي لمدة دقيقة وبسرعة بطيئة ويعتبر هذا التخفيف الأول 1/10 مل بإضافة 5 مل إلى 45 مل من الماء المعقم.

2- صبَ الأطباق / يحضر عدد من الأطباق الفارغة ويضاف 1 مل من التخفيف المراد دراسته ويصب فوقه وسط زرعي ملائم مضاف إليه مضاد حيوي لمنع نمو البكتريا مثل:

Neo-pepton glucose 

Rose Bengal auromycin Agar 

Gelatin – glucose Agar

Liver extract Agar

Potato Dextrose Agar ( P.D.A)

 

3- تحضين الأطباق / تحضن بدرجة حرارة الغرفة لمدة 5-7 أيام وتعد المستعمرات وعادة تعد الأطباق الحاوية على 50-60 مستعمرة لحد 300 مستعمرة وتهمل الأطباق المزدحمة وتشخص المستعمرات ؟ 

 

B- طريقة الطعم Baiting method 

C- طريقة التنبيذ Centerfugation method

D- طريقة الترشيح Filteration method 

التربة هي الطبقة الرقيقة التي تغطي سطح الأرض والتي تختلف اختلافا تركيبيا عن الطبقات السفلى منها  يتراوح سمك التربة من بضعة سنتمترات إلى مترين أو ثلاث أمتار رغم أنها تشكل جزءا قليلا من الأرض إلا أنها في غاية الأهمية على المستوى الذي يتعلق بالحياة , فالنبات يستمد تغذيته وحمايته منها والحيوانات تعتمد على النباتات في حياتها وهي موطن للإحياء المجهرية التي تشمل البكتريا والبكتريا الخيطية والطحالب والفطريات والابتدائيات .

 

طرق عزل الإحياء المجهرية Isolation Method of Soil Microorganisms/

================================================

 المزارع النقية: يقصد بها تلك المزرعة أو نمو الكائن ألمجهري لوحده دون وجود أي كائن مجهري أخر وللحصول على ذلك بإحدى الطرق التالية : 

أولا- طريقة التخطيط Streaking Method 

تستعمل هذه الطريقة للحصول على مستعمرات منفردة عن بعضها من مزارع سائلة أو انتخاب مستعمرة منفصلة نامية على وسط زرعي صلب.

طريقة العمل 

1- تؤخذ نماذج من ترب مختلفة حيث تحدد منطقة معينة وتجمع نماذج من خمس مناطق منها اربعة من الأطراف وأخرى من المركز بعد إزالة المنطقة العليا من التربة لأنها تكون معرضة لأشعة الشمس فيؤخذ تقريبا بمسافة 50 سم من العمق  . تجلب للمختبر وتخلط مع بعضها .

2- يوزن 1 غم من نموذج التربة ويضاف إلى أنبوبة اختبار حاوية 9 مل ماء مقطر معقم وبذلك يكون التخفيف 1×10 -1  ثم يؤخذ1 مل من التخفيف الأول يضاف إلى أنبوبة اختبار أخرى حاوية 9 مل ماء مقطر معقم وبذلك يكون التخفيف 1×10 -2  وهكذا حتى نصل للتخفيف 1×10 -3  مع مراعاة عمل ثلاث مكررات لكل تخفيف .

3- ينقل تقريبا 1 مل من العالق الأخير بواسطة إبرة التلقيح إلى طبق حاوي على وسط Nutrient Agar بالنسبة للبكتريا ووسط PDA بالنسبة للفطريات.

4- تخطط 1 مل من العالق بالطبق بواسطة swab أو Loop حسب الرسم أدناه  

5- تحضن الأطباق بدرجة 25-30 م0 لمدة 7 أيام ثم تفحص المستعمرات النامية بصورة منفصلة .

6 - تنقل كمية من النمو وتزرع على الاكار المائل وتحفظ عند درجة حرارة  منخفضة أو في الثلاجة لحين الاستعمال . 

 

ثانياً- طريقة النشر Spreading Method / تصلح هذه الطريقة للحصول على مزارع نقية من عالق يحوي من أنواع مختلفة من الإحياء المجهرية. 

طريقة العمل 

1- نقل كمية من عالق التربة وتوضع في مركز الوسط ألزرعي الصلب ( يجب تخفيف العالق إذا كانت كثافة النمو عالية قبل عملية النقل ) .

2- بواسطة قضيب زجاجي مثلث النهاية معقما ينشر النموذج المنقول عادة.  1 مل على سطح الوسط الصلب باتجاهات متعامدة وفي جميع الاتجاهات لضمان نشر الخلايا بصورة منفصلة . 

3- تحضن الأطباق بدرجة 25-30 م0 لمدة 7 أيام ثم تفحص المستعمرات النامية بصورة منفصلة .

4- تنقل كمية من النمو وتزرع على الاكار المائل وتحفظ عند درجة حرارة  منخفضة أو في الثلاجة لحين الاستعمال .

 

عزل البكتريا  الهوائية المكونة للابواغ  of Sporelation Isolation

bacteria       

==========================================

 

    توجد هذه البكتريا في الترب وتكون السبورات عندما تكون الظروف البيئية غير ملائمة لنمو وانقسام الخلايا الخضرية مثل ارتفاع وانخفاض درجات الحرارة في التربة أو نقص المواد الغذائية وتقسم هذه البكتريا حسب حاجتها للأوكسجين إلى هوائية حيث توجد في سطح التربة مثل Bacillus   ولاهوائية حيث توجد في أعماق التربة أكثر من 50 سم تحت سطح التربة مثل Clostridium . 

 

     طريقة العمل 

1-  تؤخذ نماذج مختلفة من ترب زراعية من سطح التربة ورملية .

2- يوزن 1 غم من نموذج التربة ويضاف إلى أنبوبة اختبار حاوية ( 9 ) مل ماء مقطر معقم وبذلك يكون التخفيف (1×10 -1 ) ثم يؤخذ أمل من التخفيف الأول يضاف إلى أنبوبة اختبار أخرى حاوية 9 مل ماء مقطر معقم وبذلك يكون التخفيف ( 1×10 -2 ) وهكذا حتى نصل للتخفيف( 1×10 -3)  مع مراعاة عمل ثلاث مكررات لكل تخفيف .

3- توضع أنابيب التخفيف في حمام مائي عند درجة (80 ) م0 لمدة ( 20) دقيقة لقتل الخلايا الخضرية غير المكونة للابواغ ولضمان الحصول على الابواغ التي تستطيع البقاء حية ضمن هذه المدة .

4- ينقل ( 0.1 – 1) مل من كل أنبوبة إلى طبق بلاستيكي ثم يصب عليه الوسط ملائم PDA  أو Nutrient Agar عند درجة حرارة (40) م0  ثم تخلط العينة مع الوسط بتحريك الطبق رحويا ثم يترك الوسط ليتصلب .

5- تحضن الأطباق بدرجة( 25-30 ) م0 لمدة ( 7) أيام .

6- تفحص المستعمرات النامية وذلك بأخذ مسحة وتصبغ بصبغة الابواغ أو صبغة كرام , حيث تلاحظ الخلايا الخضرية والخلايا المكونة للابواغ وموقع البوغ البكتيري .

عزل البكتريا  اللاهوائية المكونة للابواغ 

====================

1-  نماذج من ترب مختلفة بأعماق (50) سم .

2-  يوزن 1 غم من نموذج التربة ويضاف إلى أنبوبة اختبار حاوية (9 ) مل ماء مقطر معقم وبذلك يكون التخفيف (1×10 -1)  ثم يؤخذ أمل من التخفيف الأول يضاف إلى أنبوبة اختبار أخرى حاوية 9 مل ماء مقطر معقم وبذلك يكون التخفيف (1×10 -2)  وهكذا حتى نصل للتخفيف (1×10 -3)  مع مراعاة عمل ثلاث مكررات لكل تخفيف .

3-  تحضر أوساط زرعيه لاهوائية ( سائلة وصلبة ) مثل وسط Thioglycolat medium  و Clostridium medium   إن هذه الأوساط تحوي عناصر مختزلة تتفاعل مع الأوكسجين وكذلك تحوي على كواشف وعند تغيرها تؤكسد وحصول تفاعل . مثل وسط Thioglycolat medium  يحوي على Sodium Thioglycolat  وعلى الكاشف Methylene blue وتوضع هذه الأوساط في أنابيب اختبار . أحيانا يضاف إلى بعض الأوساط صبغة Crystalviolet الزرقاء ككاشف . 

4- توضع أنابيب التخفيف في حمام مائي عند درجة ( 80 ) م0 لمدة (20) دقيقة.

5- بواسطة أنبوبة شعرية معقمة تؤخذ كمية من كل تخفيف  (0.1 – 0.2)  مل وتغرز داخل الاكار إلى عمق قريب من قعر الأنبوبة ثم يدفع النموذج تدريجيا إلى الأعلى . ويمكن إذابة كمية من شمع البرافين وتصب في الأنابيب  لتكوين طبقة عازلة بين الهواء وسطح السائل ( خلق ظروف لاهوائية ) . 

6-  تحضن الأطباق بدرجة (25-30 ) م0 لمدة (7 ) أيام .

7-  يفحص النمو بملاحظة منطقة ضبابية كثيفة في الأوساط الصلبة ووجود العكورة في الوسط السائل . 

عزل البكتريا  الهوائية المكونة للابواغ  of Sporelation Isolation

bacteria       

==========================================

    توجد هذه البكتريا في الترب وتكون السبورات عندما تكون الظروف البيئية غير ملائمة لنمو وانقسام الخلايا الخضرية مثل ارتفاع وانخفاض درجات الحرارة في التربة أو نقص المواد الغذائية وتقسم هذه البكتريا حسب حاجتها للأوكسجين إلى هوائية حيث توجد في سطح التربة مثل Bacillus   ولاهوائية حيث توجد في أعماق التربة أكثر من 50 سم تحت سطح التربة مثل Clostridium . 

     طريقة العمل 

7-  تؤخذ نماذج مختلفة من ترب زراعية من سطح التربة ورملية .

8- يوزن 1 غم من نموذج التربة ويضاف إلى أنبوبة اختبار حاوية ( 9 ) مل ماء مقطر معقم وبذلك يكون التخفيف (1×10 -1 ) ثم يؤخذ أمل من التخفيف الأول يضاف إلى أنبوبة اختبار أخرى حاوية 9 مل ماء مقطر معقم وبذلك يكون التخفيف ( 1×10 -2 ) وهكذا حتى نصل للتخفيف( 1×10 -3)  مع مراعاة عمل ثلاث مكررات لكل تخفيف .

9-       توضع أنابيب التخفيف في حمام مائي عند درجة (80 ) م0 لمدة ( 20) دقيقة لقتل الخلايا الخضرية غير المكونة للابواغ ولضمان الحصول على الابواغ التي تستطيع البقاء حية ضمن هذه المدة .

10- ينقل ( 0.1 – 1) مل من كل أنبوبة إلى طبق بلاستيكي ثم يصب عليه الوسط ملائم PDA  أو Nutrient Agar عند درجة حرارة (40) م0  ثم تخلط العينة مع الوسط بتحريك الطبق رحويا ثم يترك الوسط ليتصلب .

11- تحضن الأطباق بدرجة( 25-30 ) م0 لمدة ( 7) أيام .

12- تفحص المستعمرات النامية وذلك بأخذ مسحة وتصبغ بصبغة الابواغ أو صبغة كرام , حيث تلاحظ الخلايا الخضرية والخلايا المكونة للابواغ وموقع البوغ البكتيري .

عزل البكتريا  اللاهوائية المكونة للابواغ 

8-  نماذج من ترب مختلفة بأعماق (50) سم .

9- يوزن 1 غم من نموذج التربة ويضاف إلى أنبوبة اختبار حاوية (9 ) مل ماء مقطر معقم وبذلك يكون التخفيف (1×10 -1)  ثم يؤخذ أمل من التخفيف الأول يضاف إلى أنبوبة اختبار أخرى حاوية 9 مل ماء مقطر معقم وبذلك يكون التخفيف (1×10 -2)  وهكذا حتى نصل للتخفيف (1×10 -3)  مع مراعاة عمل ثلاث مكررات لكل تخفيف .

10- تحضر أوساط زرعيه لاهوائية ( سائلة وصلبة ) مثل وسط Thioglycolat medium  و Clostridium medium   إن هذه الأوساط تحوي عناصر مختزلة تتفاعل مع الأوكسجين وكذلك تحوي على كواشف وعند تغيرها تؤكسد وحصول تفاعل . مثل وسط Thioglycolat medium  يحوي على Sodium Thioglycolat  وعلى الكاشف Methylene blue وتوضع هذه الأوساط في أنابيب اختبار . أحيانا يضاف إلى بعض الأوساط صبغة Crystalviolet الزرقاء ككاشف . 

11- توضع أنابيب التخفيف في حمام مائي عند درجة ( 80 ) م0 لمدة (20) دقيقة.

12- بواسطة أنبوبة شعرية معقمة تؤخذ كمية من كل تخفيف  (0.1 – 0.2)  مل وتغرز داخل الاكار إلى عمق قريب من قعر الأنبوبة ثم يدفع النموذج تدريجيا إلى الأعلى . ويمكن إذابة كمية من شمع البرافين وتصب في الأنابيب  لتكوين طبقة عازلة بين الهواء وسطح السائل ( خلق ظروف لاهوائية ) . 

13- تحضن الأطباق بدرجة (25-30 ) م0 لمدة (7 ) أيام .

14- يفحص النمو بملاحظة منطقة ضبابية كثيفة في الأوساط الصلبة ووجود العكورة في الوسط السائل . 

بعض العلاقات بين الأحياء المجهرية للتربة والمجموعة الجذرية للنباتات /

==========================================

  تتأثر الأحياء المجهرية في التربة بعوامل بيئية كثيرة منها وفرة المواد العضوية ودرجة الحرارة ودرجة تركيز ايون الهيدروجين والأوكسجين وغيرها .

وتؤثر الأحياء المجهرية  على بعضها إيجابا أو سلبا لذلك فان عملية التوازن الميكروبي في التربة في تغيير مستمر تبعا لتأثير مجمل العوامل ومنها العلاقات بين الإحياء وتشمل مايلي : 

1- التعاقب Succession  / تمتلك الأحياء المجهرية للتربة إنزيمات تحلل المواد العضوية المعقدة إلى مواد ابسط وهذه المواد الوسطية أو النهائية الناتجة عن التحلل تستغلها  إحياء مجهريه أخرى  لاتمتلك الأنظمة الإنزيمية المتكاملة والتي تحلل المواد العضوية المعقدة . لذلك تسود أولا المجموعة الأولى من الإحياء المجهرية ثم تليها مجموعة أخرى .

إن حالة التعاقب تعتمد على السلسلة الغذائية مثال ذلك يمتلك الفطر A.terreus و بكتريا 

flavigena  Cellulomonas النظام الإنزيمي الكامل لتحلل Cellulases  المسؤول عن تحلل السليلوز . إذ تستغله إحياء مجهريه أخرى مثل بكتريا Azotobacter وبذلك يزاد تعداد البكتريا الأخيرة في ظروف وجود الإحياء المجهرية المحللة للسليلوز .

2-التنافس Competition  / تعتمد حالة التنافس على عدد عوامل منها :

A. طبيعة الإنزيمات التي تنتجها الإحياء المجهرية فيما إذا كانت طبيعية أو محفزة .

B.  فاعلية الإنزيمات Enzyme activity.

C.  سرعة النمو.

D. العوامل البيئية.

 

 3- التضاد Antagonism

تنتج بعض الأحياء المجهرية مواد مثبطة أو قاتلة أو محللة لإحياء مجهريه أخرى تسمى هذه العلاقة بالتضاد  

4- الأحياء المجهرية للتربة والمجموعة الجذرية للنباتات ( التعايش )

توجد الأحياء المجهرية في منطقة الشعيرات الجذرية Rhizosphere بأعداد كثيرة أكثر من أعدادها في التربة البعيدة عن الجذور وفي معظم الأحيان البكتريا يفوق عددها بقية أنواع الأحياء المجهرية الأخرى أي إن الاعفان والبكتريا الخيطية توجد بأعداد قليلة . وفي منطقة الشعيرات الجذرية لبعض النباتات تكاد إن تكزن معدومة وخاصة في المنطقة الملاصقة للجذور المسماة Rhizoplane  .

إن هذا التعداد قد يتأثر بعوامل عديدة

1- التنافس والتضاد بين الأحياء المجهرية.

2-  طبيعة إفرازات الجذور التي قد تكون بعض مكوناتها محفز للبكتريا ( بكتريا معينة دون سواها ) ومثبطة لمجموعة أخرى .

3- الظروف البيئية الأخرى تلعب دورا في هذه العلاقة .

إن نسبة أعداد - الأحياء المجهرية في منطقة Rhizosphere إلى نسبة أعدادها في التربة Soil البعيدة تمثل S:R قد تكزن هذه النسبة مضاعفة لذلك فالرقم الناتج يعد أهم المؤشرات المهمة في علاقة - الأحياء المجهرية   ( البكتريا بصورة خاصة )  والمجموعة الجذرية لنبات معين .

 

طريقة العمل 

1. تسحب نباتات معينة من التربة مع المجموعة الجذرية بعناية .

2. يوزن 1غم من الجذور والتربة العالقة بها .

3. تهرس الجذور مع كمية من الرمل الابيض المعقم ثم توضع محتويات الصحن في دورق مخروطي سعة 250 مل ثم تغسل ماتبقى في الصحن ويضاف  الماء للدورق بحيث يصبح الحجم النهائي 99 مل . يضاف إليه 1غم . أصبح التخفيف 1/100.

4. تجري سلسلة التخافيف إلى إن نصل إلى 1/108.

5. يؤخذ 0.1 مل من التخافيف الأخيرة وتصب في وسط أكار مستخلص التربة Soil extract agar. ويمزج مع العينة وتترك الأطباق للتصلب .

6. تحضن الأطباق بدرجة 28 م0 لمدة 3 أيام .

7. من جانب أخر تجري نفس العمليات السابقة من التخافيف واخذ نفس التخافيف لعينة التربة المأخوذة من المنطقة البعيدة عن الجذور . 

8. وبعد ثلاث أيام يتم حساب عدد المستعمرات ويضرب في مقلوب التخفيف للحصول على عدد الخلايا في 1 غم من الجذور أو في في 1 غم من التربة. وتستخرج S:R.

S يمثل عدد الأحياء المجهرية في التربة (المنطقة البعيدة عن الجذور).

R يمثل عدد الأحياء المجهرية منطقة Rhizosphere (لمنطقة حول الجذور).

عزل الاعفان والخمائر  Yeasts &Isolation of Mold 

==================================

     توجد أعفان مختلفة  وكثيرة العدد في التربة تستخدم طرق عديدة وأوساط مختلفة  خاصة لعزله أجناس معينة منها أما الخمائر فتوجد بأعداد قليلة ؟

    طريقة العمل 

5-  تؤخذ نماذج من ترب مختلفة .

6-  يوزن 1 غم من نموذج التربة ويضاف إلى أنبوبة اختبار حاوية 9 مل ماء مقطر معقم وبذلك يكون التخفيف 1×10 -1  ثم يؤخذ امل من التخفيف الأول يضاف إلى أنبوبة اختبار أخرى حاوية 9 مل ماء مقطر معقم وبذلك يكون التخفيف 1×10 -2  وهكذا حتى نصل للتخفيف 1×10 -3  مع مراعاة عمل ثلاث مكررات لكل تخفيف .

7- ينقل 1 مل  في حالة عزل الاعفان و0.5 مل في حالة عزل الخمائر من كل أنبوبة إلى طبق بلاستيكي ثم يصب عليه الوسط ملائم PDA  أو  وسط روز بنكال Rose Bengal medium بالنسبة للاعقان ووسط مستخلص الخميرة extract Agar Yeasts أو وسط مستخلص الشعير extract Agar Malt بالنسبة للخمائر ثم تخلط العينة مع الوسط بتحريك الطبق رحويا ثم يترك الوسط ليتصلب .

8-  تحضن الأطباق بدرجة 25-30 م0 لمدة 7 أيام .

9-  تفحص المستعمرات حسب ماذا ؟؟

10- يفحص مايلي بعد استخدام شريحة زجاجية حاوية على قطرة من اللاكتوفينول  :

1- تشعبات خيوط العفن Hyphae.

2- أشكال الكونيديا وحواملها Conidiaphore Conidia & .

3- أشكال حافظات الابواغ وحواملها .

4- أشكال الابواغ .

أما الخمائر فتفحص المستعمرات الخمائر مسطحة ومعتمة اللون ذات ألوان بيضاء بعضها وردية أو برتقالية اللون . أما الفحص ألمجهري: 

1- تؤخذ شريحة زجاجية وتوضع عليها قطرة ماء تنقل جزء من العينة وتمزج معها ثم تترك العينة لتجف بدرجة حرارة الغرفة .

2- تصبغ الشريحة بصبغة ازرق المثلين Methylene blue مدة دقيقة واحدة وتغسل بالماء وتترك لتجف.

3- تفحص تحت المجهر لتلاحظ أشكال الخمائر وتكوين البراعم.

عزل الاعفان المنتجة لمضادات الحياة that prouced Antibiotic Isolation of Mold 

 طريقة العمل 

1. تعمل تخافيف لنماذج التربة .

2. ينقل تقريبا 1 مل من التخافيف المختارة إلى أطباق معقمة ثلاث مكررات لكل تخفيف.

3. يصب الروز بنكال وتمزج العينة مع الوسط وتترك الأطباق للتصلب ثم تحضن بدرجة حرارة 25م0 لمدة 5 أيام .

4. من جانب أخر تم تنمية فطريات أو بكتريا مسبقا على الأوساط PDA و Nutrient Agar  حيث يعمل منه عالق ويؤخذ 0.2 مل  من العالق وينقل إلى الأطباق الحاوية على وسط الروز بنكال .

5.  تحضن الأطباق بدرجة 25-30 م0 لمدة 7 أيام .

6. تلاحظ مناطق التثبيط حول المستعمرات الحاوية على البكتريا والفطريات .

 

التلوث بالمبيدات والمواد الكيمياوية وإزالة ذلك التلوث بواسطة الأحياء  التربة المجهرية 

Biodigradation of Pesticids &other chemical Pullutants by Soil               Microorganisms

     تستخدم كميات كبيرة من المبيدات في مكافحة الآفات الزراعية ( حشرات, أمراض النبات, أعشاب, أدغال ). يبقى الكثير من هذه المبيدات و والمواد الكيمياوية المستخدمة في الصناعات الكيميائية في التربة مدد طويلة تصل إلى سنوات كثيرة مع الاستمرار في الاستخدام الغير علمي يزيد من تراكم هذه المواد في البيئة وله تأثيرات خطيرة على الحياة سواء بالنسبة للإنسان أو الحيوان أو النبات , وكذلك بالنسبة للتوازن المايكروبي في البيئة إذ إن الكثير من هذه المواد تسبب أمراض فسلجية وسرطانية وتحدث طفرات وراثية غير مرغوب فيها . 

إضافة لذلك إن استعمال المبيدات الكيميائية غير كافية للسيطرة على المسببات المرضية للأسباب منها:

1. صعوبة إيصالها إلى الأعماق الملائمة في التربة .

2. كلفتها العالية . 

3. تلويثها للتربة.

4. تأثيرها على أحياء التربة المفيدة .

5.  خطورة استعمالها على العاملين .

6. احتياجها لأجهزة متخصصة .

    لذا اتجه الباحثين لتسخير أحياء أو كائنات بحيث تكون مفيدة للتربة وغير مؤثرة على الأحياء الأخرى إضافة لكونها غير مرضية.

     وتعد بكتريا Pseudomonas fluorescens و Bacillus subtilus  و 

cereus Bacillus من البكتريا المهمة والمستخدمة مكافحة المسببات المرضية وتمتلك عد من الآليات التي تستطيع من خلالها السيطرة على الممرضات النباتية في التربة وتشمل :

1- تحفيز نمو النبات Plant growth promoting / يشمل تحفيز النبات تنظيم حركة المواد العضوية أو توفيرها العناصر الغذائية بشكل جاهز للنبات والتي تؤدي إلى زيادة المحاصيل وبشكل اقتصادي , إذ تستعمل البكتريا بشكل سمادا حيويا Biofretilizer وهي عبارة عن أحياء مجهريه تعمل على اتساع النظام الجذري وزيادة في إنبات البذور ويختلف السماد الحيوي عن السماد العضوي والكيمياوي في تقنية إنتاجه ويكون بسيط وكلفة تجهيزه قليلة فضلا عن تأثيره في نمو النبات وحاصلة أفضل .

2- التنافس على المغذيات Competition of Nutrients  /  احد أهم الوسائل التي تستطيع من خلالها البكتريا تقليل أو منع حدوث المرض أو إنبات جراثيم الفطر أو نمو المايسيليوم .

وتشير الدراسات إن التنافس في التربة يحصل على عنصرين مهمين هما الكاربون C)) و النتروجين ( N) إذ تكون البكتريا أكثر فعالية وقدرة على اخذ العنصرين وتمثيلهما . الأمر الذي يؤدي إلى انخفاض نسبهما ومن ثم كبح نمو الممرضات إذ تكون البكتريا قادرة على 

التنافس مع مسببات أمراض الجذور على الكاربون لكونها تستعمل معظم مصادر الكاربون الناتجة عن إفرازات الجذور لغرض نموها .

 

3- إنتاج المركبات الخالبة للحديد Production of Siderphoers  /

     المركبات الخالبة للحديد Siderphoers   مركبات ذات وزن جزيئي واطئ لها قدرة عالية على الارتباط بايون ألحديديك ذات تركيب كيمياوي يختلف باختلاف الميكروبات المنتجة لها , فقد تكو Phenolate type أو Carboxylate type   أو Hydeoxamate type  أو مركبات Cutecholes التي تتخصص البكتريا في إنتاجها فقط . 

وتتميز بكتريا Pseudomonas fluorescens بإنتاجها ل Siderphoers بينما لاتنتج بكتريا Bacillusهذا النوع أو أي نوع من المركبات الخالبة للحديد.

إضافة لذلك تتميز بكتريا  P. fluorescensبإنتاجها لمادة Fluorescent Siderphoers  وهو مركب قابل للانتشار يرتبط بالحديد ويكون مركبا مخلبيا مع الحديد Iron Chelating Siderphoers  وهو مركب مختزل شديد لايونات الحديد Fe+3 , وان استعمال هذا المركب أو السلالات البكترية المنتجة له يعمل على كبح ونمو الفطريات ويوفر حماية للنادرات من مرض السقوط وموت وتعفن النادرات المتسبب عن عدد من الفطريات منها Rhizoctonia solani أو Pythium.

4- إنتاج المضادات الحياتية of Antibiotic   Production

     إن إنتاج المضادات الحياتية هو احد الوسائل المهمة التي تستطيع من خلالها البكتريا كبح نمو الممرضات ونشاطها وهي إلية فعالة في تثبيط مسببات أمراض التربة إذ تعد سلالة بكتريا CHAO P. fluorescens  من أكثر السلالات تأثيرا من حيث التضاد وتعد كائنا حيويا كفؤا جدا في مقاومة الكثير من الممرضات المتوطنة في التربة Soil borne من خلال إنتاجها Antibiotic  مثل سيانيد الهيدروجين HCN و Oomycin و Pyoluteorin و Phenazinel Carboxylic acid و Pyoverdine و Salicylic acid و  Diaacetyl pholoro glucinol( Phi) -2-4

   و Mono acetyl pholoro glucinol( Mphi)  .

   أما بكتريا Bacillus فأنها تنتج عدد من المضادات الحياتية لمهمة في كبح نشاط الفطريات منها Iturin A و Surfactin  و Mycosubtilin  و Bacillysoin  و Fengycin و  Bactericin و Subtilosin و Tas A و Difficidin وOxydifficidin  وغيرها من المضادات .

5- اثر البكتريا في تحفيز المقاومة الجهازية Induced Systematic Resistance ( I.S.R.) 

    بدء الاهتمام بصورة كبيرة بالمقاومة المستحثة لأثرها الفعال في نمو ومقاومة الأمراض النباتية عرفت تحفيز المقاومة الجهازية من قبل عدد من الباحثين بأنها عملية مقاومة فعالة تعتمد على تكوين مواد كيمياوية أو حواجز فيزياوية للنبات المضيف وتستحث بفعل عوامل حيوية أو غير حيوية .

إن تحفيز المقاومة الجهازية من الطرق الفعالة في السيطرة البايولوجية على الأمراض النباتية الهوائية وكذلك الموجودة في التربة وتتم عن طريق عوامل حيوية غير مرضية موجودة في منطقة المحيط لجذري تمثلت بأنواع تابعة لجنس البكتريا Pseudomonas و Bacillus  على إن لايحدث تفاعل مباشر بين البكتريا والممرض .

وأوضحت الدراسات إن طرق السيطرة التي تمتلكها البكتريا تعمل بصورة تازرية  مما تؤدي إلى تحسين فعالية السيطرة بشكل كبير , إذ إن إنتاج المضادات الحياتية وتحفيز المقاومة الجهازية تعتبر من الطرق المتتمة أو المكملة احدهما لأخرى في كبح نشاط الممرض . فالمضادات الحياتية تقوم أولا بإضعاف أو قتل جزئي للمرض تليها حدوث حالة دفاعية كبيرة تتجه لتحفيز آليات دفاع النبات والذي ينعكس سلبا على تطور المرض . 

6- اثر البكتريا في إنتاج منظمات النمو النباتية / تنتج الكثير من الأحياء الدقيقة في التربة  وخاصة البكتريا بعض المواد المنشطة للنمو وظهرت هذه التأثيرات في منطقة Rhizosphere لجذور النبات وعزيت تأثيراتها إلى إنتاج هذه الأحياء للاوكسين Indol Acetic Acid ( I.A.A)  وكان السبب إن هذه الأحياء تنتج اوكسينات وجبرلينات وسايتوكينيات في منطقة Rhizosphere . لها القدرة على تشجيع نمو النبات عندما تضاف للبذور أو الجذور أو الأوراق من خلال إفراز المواد المشجعة للنمو يطلق على هذه الأنواع من البكتريا اسم بكتريا الجذور المشجعة لنمو النبات P.G.P.R)) Plant Growth Promoting Rhizobecteria  وتشمل أجناس التالية Pseudomonas و Bacillus وAzotobacter . 

 

المكافحة المتكاملة /

===========

إن الاتجاه نحو المكافحة المتكاملة يعد الاتجاه الأمثل في مكافحة أمراض النبات أذا استعملت المكافحة الحيوية جنبا إلى جنب مع المكافحة الكيميائية بنجاح ضد العديد من الفطريات الممرضة للتربة . 

إن الاستعمال الواسع للمبيدات أدى إلى إفساد النظام البيئي تسبب في زيادة عدد الآفات من خلال ظهور سلالات مقاومة تفوقت على الأصول التي انحدرت منها من حيث المخاطر وإلحاق أفدح الخسائر بالمحاصيل الزراعية المختلفة  .

إن الاستعمال الواسع للمبيدات ودورها لايقتصر على زيادة ا مشاكل الآفات  فحسب وإنما مخاطرها على جميع الكائنات الحية الأخرى بشكل مباشر أو غير مباشر مما زاد في الأصوات الداعية إلى ضرورة تطبيق المبادئ الحيوية والطبيعية لمعالجة أو مقاومة الآفات في حين نادي البعض الأخر إلى إمكانية استعمال المبيدات  ضمن نطاق ضيق مع طرائق المكافحة الأخرى وهو مايعرف اليوم بالمكافحة المتكاملة .

فمثلا يتم وضع نترات الامونيوم NH4NO2  والمبيد الحيوي المقاوم لفطر Trichoderma harzianum قد أدى  إلى خفض نسبة تعفن جذور الفاصوليا المتسبب عن الفطر Sclerotina rolfsii . إضافة لذلك وجد إن استخدام التكامل بين المبيد الكيميائي كابتان Captan والفطر Penicillium purpugen  في مقاومة الفطر Fusarium oxysporum.f.sp.lycopersic المسبب مرض ذبول نبات الطماطة .